De estilo herreriano, el retablo mayor de la basílica tardó cuatro años en ser terminado, por contrato firmado entre los artistas Jácome Trezzo, Pompeo Leoni y Juan Bautista Comane con Felipe II y la congregación monasterial. De arriba a abajo, la obra está dividida en cuatro cuerpos: el primero dórico, al que siguen otro jónico, corintio y, por último, de orden compuesto. El mármol, el jaspe y el bronce son los materiales preponderantes y las esculturas que cierran los laterales, son de mayor tamaño a medida que se alza la mirada –de 1,95m a 2,50m–. Contiene pinturas de Pellegrino Tibaldi y Federico Zuccaro. Felipe II había encargado previamente al pintor italiano Tiziano una versión de «El Martirio de San Lorenzo», pero la obra era muy oscura y no lucía bien, por lo que fue situada en la vecina Iglesia vieja o de prestado, donde todavía hoy continúa.